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QuanNUA 核酸分型質譜的 10 種鴨源性致病病毒的快速檢測,方法特異性良好

QuanNUA 核酸分型質譜的 10 種鴨源性致病病毒的快速檢測,方法特異性良好

儀器與試劑

目標鴨源性病原體包括 DHAV-1 分離株 C80(DQ864514)、DHAV-3 分離株 C-GY(EU352805)、DAstV-1 分離株 D17(MN149392)、DAstV-2 分離株 SL4 (KF753806)、DRV-1 分離株 815-12(KC508656)、DRV-2 分離株 091(JX478256)、 TMUV 分離物 PS(KT876991)、GPV 分離物 JS1(KT935531)和 DEV 來自中國 農業大學獸醫學院。AIV 亞型 H9N2(GQ373128)由中國農業大學禽流感實驗室 提供。所有這些病毒在檢測前均經 RT-PCR/PCR 鑒定。非靶標鴨源性病原菌包括 大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里默氏菌,均來自中國農業大學獸醫學院。2.5×PCR mix、質量探針試劑盒,以及 QuanTOF 質譜儀及 QuanNUA 軟件,均來自于融智 生物科技(青島)有限公司

實驗方法

分別下載 10 種病毒的基因組序列,針對選定的靶基因,設計質粒構建用引物和檢測用引物,分別構建了標準 質粒,建立檢測方法,并確定檢測方法的特異性;對標準質粒進行 10 倍系列稀釋,確定該方法的敏感性。利用該 檢測方法對人工制備的混合感染樣品進行檢測,與普通 PCR 檢測結果進行比對。 結果與討論 結果顯示,本研究所建立的檢測方法可同時檢測到包括鴨甲肝病毒 1 型、鴨甲肝病毒 3 型、鴨星狀病毒 1 型、 鴨星狀病毒 2 型、鴨呼腸孤病毒 1 型、鴨呼腸孤病毒 2 型、坦布蘇病毒、禽流感病毒、小鵝瘟病毒和鴨病毒性腸 炎病毒等 10 種病毒和 1 種內參基因,且 10 種病毒之間的檢測結果互不干擾;對 10 倍系列稀釋的標準質粒進行檢測, 當稀釋度為 10-10 時仍能檢測到核酸,針對不同病毒的標準質粒最低檢出量為 1.3~7.8 × 100 copies,對混合樣 品的檢測結果與普通 PCR 結果一致。

研究人員用已知含有特定病毒的臨床樣品模擬了四種混合感染,對該方法進行了評價。如預期的那樣,在所 有的樣本中,都能準確地識別出目的病毒,包括 RNA 和 DNA 病毒。

結果

綜 上 所 述, 本 研 究 建 立 的 基 于 QuanNUA 核酸分型質譜的 10 種鴨源性致病病毒的快速檢 測,方法特異性良好,與普通 PCR 相比,基于 QuanNUA 核酸分型質譜的檢測方法的靈敏度大大 提高,并可對同一樣品進行多種病毒的檢測,使整 體檢測成本下降,不同病毒之間的檢測結果互不干 擾,可為鴨病毒病病原的快速診斷和分子流行病毒 學調查提供極大便利。基于核酸質譜的檢測方法, 可實現對無法以核糖體蛋白作為生物標志物的微生 物進行檢測,使 MALDI-TOF MS 有望成為對此類 微生物進行快速、高靈敏分型鑒定的新的有效工 具,具有一定的應用推廣潛力。

參考文獻

Establishment of a simultaneous detection method for ten duck viruses using MALDI-TOF mass spectrometry. Ning Liua,Lei Wanga,Gaozhe Caib,et al. [J].Journal of Virological Methods, 273 (2019) 113723.

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