中文字幕日产乱码久久久,天堂中文www资源在线,99热精品国产三级在线,欧美日产国产精品日产,亚洲狼人精品一区二区三区

致電我們

400 118 0390

MALDI 質(zhì)譜成像技術(shù)因其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢,包括實(shí)現(xiàn)多樣的分子 類型,復(fù)雜樣本上的分子空間分布等,已被多領(lǐng)域的研究引用

MALDI 質(zhì)譜成像技術(shù)因其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢,包括實(shí)現(xiàn)多樣的分子 類型,復(fù)雜樣本上的分子空間分布等,已被多領(lǐng)域的研究引用

近年來,在檢測樣本表面目標(biāo)分子的空間分布上擁有強(qiáng)大能力的 MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization) 質(zhì)譜成像技術(shù) (Imaging Mass Spectrometry, IMS) 越來越受關(guān)注。MALDI-IMS 已 被多種科研領(lǐng)域應(yīng)用,并在多樣性分子的可視化檢測上不斷突破,其中檢測的分子種類已涵蓋各種有機(jī) 小分子,化學(xué)藥物,脂類,多肽及蛋白等 1,2。無需標(biāo)記,在某些分子檢測上甚至無需任何復(fù)雜的前處理, 就可以同步得到多個(gè)或多種類分子在復(fù)雜樣本中,精確且高分辨率的空間表達(dá),這些優(yōu)勢毋庸置疑地成 為了 MALDI-IMS 的標(biāo)志。MALDI 質(zhì)譜成像技術(shù)不僅提供精確的分子質(zhì)量分布譜圖信息,還能夠在復(fù)雜 組織的結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)微米級(jí)空間分辨率的分子表達(dá)特異性,這些結(jié)果一方面為分析和觀察目標(biāo)物的區(qū)域性 分布及組織在分子級(jí)別的結(jié)構(gòu)性差異等方面帶來新的見解和發(fā)現(xiàn);另一方面,作為創(chuàng)新的成像技術(shù),可 在臨床領(lǐng)域輔助判斷受損或病變組織區(qū)域的分子構(gòu)成和變化機(jī)制,并潛在輔助尋找腫瘤標(biāo)記物等;同時(shí), 基于特異性分子的 MALDI 質(zhì)譜成像,還可以精準(zhǔn)協(xié)助個(gè)體化疾病診斷及用藥和護(hù)理等方向的指導(dǎo)。 隨著逐漸對(duì)質(zhì)譜成像技術(shù)需求的提高,標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程,包含樣本前處理與儀器采集性能在內(nèi) 的方法學(xué)優(yōu)化成為了首當(dāng)其沖的攻克目標(biāo)。本應(yīng)用介紹了一種高空間分辨率脂質(zhì)質(zhì)譜成像采集的操作流 程,該操作流程使用基質(zhì)升華法對(duì)組織進(jìn)行前處理,在 MALDI-TOF MS (QuanTOF) 上采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。 MALDI-TOF MS (QuanTOF) Imaging 的成像采集滿足 7S 指標(biāo) (Speed, Specificity, Spatial Resolution, Sensitivity, Stability, Simplicity & Size)3,4,為快速高效地達(dá)成高分辨、高靈敏的成像采集奠定了基礎(chǔ)。通 過我們的前處理及采集方法,可以快速且高效地得到靈敏度,重現(xiàn)性和分辨率均良好,可信度較高的脂 類成像數(shù)據(jù)。通過 QuanIMAGE 質(zhì)譜成像系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步處理和分析,可以得到清晰的多樣性脂類 分子在組織內(nèi)微米級(jí)別的結(jié)構(gòu)分布成像,基于譜圖的疊加與對(duì)比,成像的同源性分析等多種功能的應(yīng)用, 為進(jìn)一步分析目標(biāo)脂質(zhì)的區(qū)別性表達(dá)帶來潛在的應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)驗(yàn)

?樣本前處理直接影響質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的采集與分子成像的效果。本應(yīng)用中,根據(jù)我們優(yōu)化的組織前處理操作流程,經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證其穩(wěn)定的高分辨譜圖及成像結(jié)果,確認(rèn)了其在脂質(zhì)分子范圍內(nèi)成像應(yīng)用的實(shí)用性

A typical MSI workflow detailing steps from study design to reporting. (Figure modif ied from Swales etal., 20182 )

【樣本制備】

MALDI質(zhì)譜脂類成像的前處理主要分為三步:樣本切片,基質(zhì)升華和再水合。

【樣本切片】

質(zhì)譜成像推薦使用新鮮組織樣本。新鮮解剖組織 (六周大鼠完整腦組織) 去除表面 明顯的殘余血跡后,立即放入液氮速凍 (或者異戊烷處理),5 min - 10 min 后將組織放 于-20℃ 恒定溫度環(huán)境中 (冰箱/冷凍切片機(jī)),繼續(xù)冷凍至少 1 小時(shí)。 準(zhǔn)備就緒,使用OCT冷凍組織包埋劑 (Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 固定組織,使用冷凍切片機(jī) (CM1900/3050: Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 進(jìn)行組織樣本切片,切片厚度控制在10 μm-12 μm。使用ITO導(dǎo)電玻璃 (Intelligene Biosystems, Qingdao, China) 貼附切好的樣本切片,在低溫的冷凍切片機(jī)內(nèi)使用指腹 在切片背側(cè)加熱至完全融化貼合,以避免組織發(fā)生卷曲錯(cuò)位。

【基質(zhì)升華】

樣本切片在真空干燥器 (悅城) 中進(jìn)行15分鐘干燥后,固定于升華裝置內(nèi) (ACE Glass) 進(jìn)行升華處理: 基質(zhì):300 mg 1,5-DAN (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, U.S.A) 真空條件:4E-2 mbar 升華溫度:145℃ 2 mins + 150℃ 4 mins (6-min-process)

【再水合】

升華后樣本切片避光密封于切片盒/50 mL離心管內(nèi) (使用Parafilm進(jìn)行密封),放 入-20℃冰箱2小時(shí)5 。再水合后樣本在切片盒內(nèi)可使用鋁膜避光真空封裝,4℃環(huán)境內(nèi) 保存,三天內(nèi)完成樣本采集。

【質(zhì)量校準(zhǔn)】

Standard Kit:Bradykinin Fragment 1-7 & Angiotensin II, CHCA

【樣本檢測】

再水合后樣本/從真空密封狀態(tài)取出的樣本可進(jìn)行短時(shí)間的常溫恢復(fù)及真空干燥, 樣本放置于MALDI-TOF MS (QuanTOF) 成像載靶器上,通過控制器軟件(QuanTOF Controller)操作載入儀器內(nèi)。選擇采集區(qū)域,設(shè)置采集方法后,提交采集任務(wù)進(jìn)行自 動(dòng)數(shù)據(jù)采集。采集完成后數(shù)據(jù)通過成像系統(tǒng)軟件 (QuanTOF Viewer) 進(jìn)行成像分析。

【MALDI-TOF MS 條件】

采集機(jī)型:QuanTOF

采集模式:線性離子模式 (Linear Ion Mode)

聚焦質(zhì)量:950 m/z

激光頻率:5,000 Hz

質(zhì)量范圍:100-1,500 m/z

加速電壓:10 kV

檢測電壓:-0.8 kV

激光能量:8 μL

激光直徑:10 μm

空間分辨率:10 μm

單譜圖激光轟擊次數(shù):10 shots

結(jié)果與討論

高空間分辨率的質(zhì)譜成像結(jié)果普遍需要超長的采集時(shí)間,甚至需要把組織分割為多個(gè) 區(qū)域,先后加載到質(zhì)譜儀中采集,以降低基質(zhì)在真空下?lián)]發(fā)/升華的影響(較大面積的組 織受到基質(zhì)不均勻影響的主要表現(xiàn)包括陰陽面,成像不均勻等)。因此以成像采集的速 度與效率兼得為主的目標(biāo)被視為主要的攻克難點(diǎn)之一6。升華法沉積基質(zhì)后的效果請(qǐng)參考 圖片1(Figure 1),基質(zhì)附著均勻,組織輪廓清晰。使用QuanTOF MS進(jìn)行成像采集,空 間分辨率為10 μm的完整大鼠鼠腦成像數(shù)據(jù) (質(zhì)量校準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)據(jù)除外) 共計(jì)120 GB,采集總時(shí) 長約4小時(shí)20分鐘??傮w質(zhì)量出峰分辨率 (Resolution) 可達(dá)到同位素峰間分離 (Figure 2) ,低質(zhì)量區(qū)域可達(dá)到基線分離。單譜圖平均分辨率可達(dá)1.5K+,最高可達(dá)2K+。譜圖上組 織內(nèi)區(qū)別性表達(dá)的分子出峰信息豐富,質(zhì)量精度可達(dá)到0.25 Da (250 ppm) 以內(nèi)。從成像 結(jié)果上可見單分子在組織結(jié)構(gòu)的區(qū)別性分布,成像完整,區(qū)域細(xì)節(jié)化清晰且空間分辨率 良好 (Figure 3 & 4)?;谫|(zhì)譜成像的7s指標(biāo),2020年質(zhì)譜成像專家Dr. Marvin Vestal 提 出的全新概念4,以標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜成像的采集儀器的性能及特點(diǎn)。通過此次實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,質(zhì) 譜成像結(jié)果達(dá)到7s標(biāo)準(zhǔn)

?

Figure 2: The spectrum with high resolution performed in IMS (Negative Ion Mode).

A. Single spectra with 10 laser shots. B. The accumulated spectrum selected from the region of cerebellum.

C. the cerebellum region selected for generation spectrum B.

7s 指標(biāo)

Speed 速度

速度指標(biāo)由多個(gè)采集參數(shù)共同決定,主要包含高激光頻 率(High Laser Rate = 5 kHz),激光掃描速度 (Motion of Sample Relative to Laser Beam = 5 mm/s),高離子化效率 (High Ionization Eff iciency ~ 50%),高速采集,處理&質(zhì)譜數(shù) 據(jù)保存速率 (High Rate ~ 500 spectra/s)。速度的局限性也與 樣本采集的質(zhì)量范圍,組織樣本處理后的分子濃度與空間分 辨率直接相關(guān)。我們此次結(jié)果的采集基于QuanTOF MALDITOF MS Imaging 可達(dá)到的最高成像采集速度500 pixel/s (with 10 laser shots/pixel),平均采集速度 300 pixel/s。

Specificity 質(zhì)量精確度

質(zhì)量精確度與質(zhì)量分辨率有關(guān),受到儀器本身的功能性 與樣本中分子的元素組成 (Elemental Formula) 局限。通過 校準(zhǔn)品的外標(biāo)法校準(zhǔn),我們可以得到同位素峰的質(zhì)量偏差在 ±0.25 Da (250 ppm) 區(qū)間內(nèi)的準(zhǔn)確度。

Figure 3: The single ion chromatogram of the mass of 888.6 Da.

?

Sensitivity 靈敏度

質(zhì)譜成像的分子采集靈敏度由離子化效率決定。離子化 效率與樣本本身和基質(zhì)的性質(zhì)直接相關(guān),即會(huì)受到樣本處理 和實(shí)驗(yàn)前處理的影響。由微米級(jí)的激光光束直徑通過少次激 光轟擊 (laser shots = 10) 樣本表面使樣本可離子化的分子氣 化,信號(hào)強(qiáng)度同樣受到樣本表面的分子濃度影響。

Stability 穩(wěn)定性

在該次采集的大鼠鼠腦樣本,連續(xù)采集空間分辨率10μm 的完整成像共計(jì)激光轟擊次數(shù)~3千萬次 (Total Laser Shots = 33,613,500) 。采集過程中真空值穩(wěn)定在8E-7 Torr,離子源 未清洗狀態(tài)下完成采集任務(wù),激光聚焦保持穩(wěn)定的10 μm, 采集能量輸出穩(wěn)定 8 μJ。 在我們的采集中未觀察到采集過 程出現(xiàn)明顯波動(dòng),結(jié)果上成像細(xì)節(jié)呈現(xiàn)均勻。

Spatial Resolution 空間分辨率

空間分辨率直接受到儀器硬件的激光光斑直徑影響。 QuanTOF MALDI-TOF MS Imaging的激光光束聚焦直徑可 以達(dá)到10 μm。定制化的儀器的激光光斑小于5 μm。

Simplicity 簡化性

除去前處理需要手動(dòng)實(shí)驗(yàn)外,成像采集過程全部由儀器 自動(dòng)完成。成像采集的方法設(shè)置也無需專業(yè)指引,可自主根 據(jù)實(shí)驗(yàn)所需條件自由且快捷地完成調(diào)整。

Size (million pixels) 數(shù)據(jù)量

除去校準(zhǔn)品采集的數(shù)據(jù)量,該次大鼠鼠腦成像數(shù)據(jù)量為 ~120GB大小,涵蓋~3百萬譜圖 (3,361,350 spectrum),約3.4 百萬像素 (10 μm ×10 μm)。